Analisis sitogentika klasik sudah mulai digantikan penggunaan dengan teknik in situ hybridization. In situ hybridization merupakan teknik cytochemical untuk menentukan letak spesifik sekuen DNA atau RNA dalam suatu organisme (McFadden, 1995). In situ hybridization (ISH) sudah banyak digunakan dan merupakan teknik yang sangat penting dalam berbagai penelitian molekuler. Teknik ini dapat memungkinkan kita untuk menentukan lokasi fisik sekuen DNA di dalam kromosom dengan tepat. Teknik ini memanfaatkan sekuens DNA yang berulang sebagai label radioactive atau biotinylatel probes untuk menentukan letak sekuens tersebut di dalam kromosom (Devi, et al. 2005).

Prosedur dalam mengidentifikasi kromosom dengan ISH memungkinkan kita untuk dapat menggunakan sinyal berpendar yang dapat mengidentifikasi sekuen, kromosom, segmen kromosom yang spesifik atau seluruh set kromosom dalam gambaran yang mudah dilihat dan baik (Kato, et al. 2005).

FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION

Teknik in situ hybridization telah mengalami berbagai macam modifikasi. Salah satunya adalah dengan dipergunakannya molekul berpendar dalam teknik tersebut (Devi, et al. 2005). Lokasi yang diberi molekul tersebut, nantinya akan berpendar dan akhirnya pendarannya dapat dilihat dengan menggunakan fluorescent microscop. Hal inilah yang membuat lokasi fisik gen pada kromosom dapat dengan tepat ditentukan. Teknik ini biasa disebut sebagai Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). Kelebihan teknik ini dibandingan dengan teknik ISH adalah dapat lebih cepat dalam mendekteksi lokasi gen atau DNA, memiliki resolusi yang tinggi, dan sentitif. Hasil analisa dengan FISH dapat dilihat pada gambar 1.

FISH JAGUNG.jpg
Gambar 1. Hasil Analisa FISH pada 10 Pasang Kromosom Jagung

Teknik FISH biasa digunakan untuk membedakan kromosom nonhomolog di dalam genom (Kato, et al. 2005). Prosedur ini penting untuk mendeteksi adanya kerusakan pada kromosom, untuk menentukan kasus aneuploid, untuk mempelajri perilaku kromosom, dan untuk menentukan lokasi fisik sekuen DNA berluang pada genom, lokus, atau gen introgesi. FISH dapat dipakai untuk mendeteksi sekuen nucleid acid dengan label probe berpendar yang disatukan secara spesifik untuk melengkapi sekuen target dalam sel utuh. Terdapat 2 metode pewarnaan dalam FISH, yaitu metode langsung dan metode tiak langsung (Devi, et al. 2005). Metode langsung dengan menggunakan fluorochrome-labelled nucleotide sebagai penanda probe, sedangkan metode tidak langsung menggunakan biotin, digoxigenin, dan dinitrophenol (DNP) sebagai reporter molekul yang nanti akan terdeteksi oleh fluocrhome-conjugated avidin atau antibodi. Metode langsung tidak menggunakan immunochemical sehingga dapat dapat lebih cepat dan menghasilkan resolusi yang baik. Berikut adalah tahapan-tahapan dalam menggunakan FISH (Moter and Gobel, 2000):

  1. Probe dan labeling

Probes untuk FISH harus spesifik, sensitif, dan mudah untuk maruk ke dalam jaringan. Terdapat tiga tipe probe, yaitu oligonucleotide, double-stranded DNA, dan single stranded DNA (Mcfadden, 1995). Tipe probe oligonucleotide berukuran antara 15 dan 30 bp. Probe yang pendek dapat lebih mudah mengkses target, tetapi ia hanya dapat membawa sedikit label. Terdapat cara yang berbeda dalam melakukan labeling. Cara langsung atau cara tidak langsung. Cara langsung lebih umum digunakan karena lebih cepat, murah, dan mudah.

  1. Fluorescent dyes

Pewarna yang umum digunakan untuk FISH dalam microbiology adalah turunan dari fluorescein (fluorescein-isothiocyanate, 5-(-6)carboxyfluorescein-N-hydroxyuccimide-ester) dan turuna dari rodamine (Tetramethyl-rhodamine- isothiocyanate, texas red) dan baru-baru ini menggunakan pewarna cyanine seperti Cy3 dan Cy5. Pendaran berwarna biru dapat dihasilkan oleh diamidines aromatic seperti 4,6-diamidino-2-phenylidole dihyrochloride (DAPI).

  1. Ribosomal RNA (rRNA) sebagar target untuk FISH

Molekul rRNA yang umum digunakan dalam bidang mikrobiologi adalah 16S rRNA. Molekul lainnya yang umum digunakan adalah seperti 5S dan 18S-5,8S-26S rRNA

  1. Fixation

Fiksasi dapat dibantu dengan menggunakan agen pengndap seperti etanol dan metanol, agen cross-linking seperti aldehid, atau kombinasi antara keduanya. Fiksasi yang baik sangat menentukan hasil dari FISH. Fiksasi yang baik harus bisa mendapatkan penetrasi probe yang baik, semaksimal mungkin dalam menyimpan RNA target, dan menjaga keutuhan sel dan morfologinya. Umumnya, larutan 3-4 % (v/v) formaldehid atau paraformaldehid baik untuk makteri geram-negatif, sedangkan untuk organisme geram positif dapat digunakan etanol (50%), etanol : formalin (9:1) atau perlakuan pemanasan.

  1. Spesimen preparation dan pretreatment

Spesimen yang lebih baik dapat diperoleh dengan memberikan agen pelapis pada permukaannya. Bahan kimia yang dapat digunakan diantaranya adalah gelatin. Pra perlakuan yang dapat dilakukan diantaranya adalah dengan perlakuan enzimatik dengan isozyme dan lysostaphin. Prosedur pra perlakuan dapat meningkatkan kemampuan probe untuk mengakses target dan mengurangi banding yang tidak spesifik.

  1. Hybridization

Hibridisasi harus dilakukan dalam kondisi yang tepat. Hibridisasi merupakan step yang penting dalam prosedur FISH. Hibridisasi dilakukan di chamber yang gelap dan lembab. Temperatur yang digunakan antara 37°C – 50°C. Waktu yang digunakan bervariasi antara 30 menit sampai beberapa jam. Kemudian, dibilas denganair destilasi. Untuk mengurangi jumlah racun dapat digunakan beberapa konsentrasi garam atau bahkan formamide. Terakhir, slide dibilas kembali dengan air dingin, kemudian keringkan, pasang, dan dokumentasi. Berbagai tahapan-tahapan tersebut dapat dilihat pada gambar 2 dan 3

Tahapan FISH
Gambar 2. Tahapan-Tahapan Analisa FISH pada Mikroorganisme

Lusiyanti, et al (2006) menjelaskan bahwa secara umum, proses FISH diawali dengan dehidrasi slide yang telah ditetesi larutan kromosom metafase ke dalam larutan serial etanol 70%, 90 % dan 100 % selama waktu tertentu. Selanjutnya slide dikeringkan (aged) di atas hot-plate suhu 65ºC selama 1,5 jam. Di lain pihak whole chromosome probe sebanyak 1 µl dalam buffernya divortex dan disentrifuse kemudian didenaturasi pada suhu 65ºC dan disimpan dalam waterbath suhu 37ºC selama 45 menit (30-60 menit). Slide berisi kromosom didenaturasi dengan menginkubasinya dalam larutan formamida dalam water-bath suhu 65ºC selama 1,5 menit dan dicuci berturut-turut dengan serial alkohol 70% dingin, 90% dua kali dan 100 % selama 5 menit.

FISH Pisang
Gambar 3. Hasil Analisa FISH pada Tanaman Pisang

Proses hibridisasi dilakukan dengan meneteskan probe pada slide yang telah didenaturasi kemudian ditutup dengan coverslip serta bagian pinggir diolesi lem kuning untuk mencegah udara masuk (penguapan). Slide diletakkan dalam lunch box berwarna gelap dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 16 jam. Setelah proses hibridisasi, coverslip dibuka dan slide direndam dalam waterbath suhu 45ºC selama 30 menit. Selanjutnya direndam berturut-turut dalam kopling jar berisi stringency wash solution dua kali, larutan 1x SSC dua kali dan akhirnya larutan detergen selama 4 menit. Setelah dikeringkan, slide ditetesi dengan DAPI dan pengamatan translokasi dilakukan di bawah mikroskop epi-fluorescence. Prosedur teknik FISH dapat berbeda-beda tergantung dari produsen probe kromosom yang digunakan.

Prosedur FISH juga telah banyak mengalami modifikasi. Hal ini sangat tergantung mengenai tujuan yang ingin dicapai oleh masing-masing peneliti. Modifikasi-modifikasi tersebut diantaranya adalah :

1)      Tyr-FISH,

2)   Three- dimensional FISH using optical-sectioning microscopy,

3)      FISH on super-strerched chromosomes, dan

4)      FISH on DNA fibers ( Jiang and Gill, 2006).

PENGGUNAAN FISH

Penggunaan in situ hibridization mamalia sudah jauh lebih berkembangkan dibandingkan penggunannya pada tanaman. Namun, sekarang teknik-teknik tersebut telah digunakan untuk penelitian pada tanaman, khususnya pada program pemuliaan tanaman. Pertama kali teknik ini digunakan pada tanaman gandum, namun sekarang teknik-teknik ini sudah berhasil digunakan pada berbagai tanaman, baik monokitol atau dikotil. Beberapa penggunaan teknik-teknik tersebut diantaranya adalah:

  1. Pemetaan kromosom

FISH telah digunakan pada banyak tanaman untuk mengidentifikasi kromosom secara akurat dengan menggunakan sekuens spesifik antar spesies, ribosomal gen (rRNA), dan sekuens-sekuen DNA yang unik. FISH menggunakan fluorochrome memungkinkan untuk menggambarkan poliploidi yang satu famili, seperti 5S dan 18S-5,8S-26S rRNA untuk menentukan lokasi mereka di dalam kromosom. Lokasi fisik gen seperti 5S dan 18S-26S rRNA dalam kromosom sedah dilaporkan terdapat pada gandum (Mukai, Endo, and Gill, 1990), tomat, barley, bawang putih, dan lain-lain. Pada kapas, banyak copy gen dipetakan oleh kromosom pada saat meiosis. Baru-baru ini, FISH digunakan untuk memetakan ribosomal gen (rRNA), mikrosatellite, dan tranposable DNA pada bit. FISH juga sudah digunakan untuk memetakan tandem sekuen berulang MR68 pada kromosom jagung dan juga digunakan untuk menentukan lokasi sekuen DNA berulang pada sub lengan kromosom pada Bassica sp. Hal ini memungkin kita untuk dapat mengidentifikasi dan memberikan informasi baru tentang struktur genom dan evolusinya.

  1. Analisis Genom

Multicolour FISH (mFISH) dengan memanfaatkan probe seluruh DNA genome memungkinkan pendekatan untuk membedakan setiap genom. mFISH menggunakan berbagai macam pewarna berpendar untuk mewarnai probe yang berbeda dalam satu waktu. Hal ini menjadikan teknik ini menjadi sangat baik untuk investigasi homologi genome antara spesies poliploid dan nenek moyangnya yang diploid. Teknik ini juga memungkinkan kita untuk dapat mengidentifikasi seluruh kromosom tertentu pada genom amphidiploid.

  1. Deteksi kromatin alien

FISH dapat digunakan untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi kromosom alien, segmen kromosom, dan gen pada program pemuliaan tanaman. Metode tersebut dapat menggambarkan dan menghitung hal-hal tersebut pada hibrida liar dan amphidiploid tidak hanya pada saat metafase tetapi juga pada saat interfase. FISH telah digunakan untuk mengidentifikasi amphidiploid parsial yang berasal dari persilangan gandum dengan Thinopyrum intermedium dan Lophopyrum elongatum dengan ketahanan terhadap BYDV dan mosaik virus.

  1. Deteksi Aberasi Kromosom

In situ hybridization memfasilitasi kita untuk dapat mendiagnosis dan mengidentifikasi kerusakan kromosom pada manusia dan hewan. Teknik memungkinkan kita untuk mengidentifikasi kerusakan kecil pada kromosom yang tidak dapat terdeksi oleh teknik banding yang biasa. FISH dapat dengan akurat menidentifikasi hampir semua trisomik pada autosom dan kromosom sex abnormal dapa manusia.

FISH normal abnormal.jpg
Gambar 4. Hasil Analisa In Situ Hybridization pada Translokasi Kromosom

 

  1. Menentukan kromosom spesifik pada tanaman

Dasar penentuan kariotipe adalah ukuran kromosom, indeks sentromer, bentuk banding. Namun, dasar-dasar tersebut kurang dapat digunakan untuk kromosom yang memiliki morfologi yang mirip. FISH atau PRINS (primed in situ labelling) dapat menjadi solusi permasalahan tersebut. FISH telah digunakan untuk menganalisis struktur dari kromosom B pada gandum.

Teknik-teknik tersebut sudah sangat membantu untuk secara simultan memetakan berbagai DNA sekuens yang berbeda dan alokasi gen pada genome. Metode probe genom melengkapi berbagai metode analisis genom yang sudah ada, memberikan data novel genom dan hubungan diantaranya, termasuk identifikasi terhadap tetua atau nenek moyang dari persilangan yang tidak diketahui attau pada berbagai spesies poliploid, informasi mengenai wilayah genomik pada berbagai spesies yang berbeda, dan memungkinkan identifikasi yang lebih jelas mengenai parpasangan saat meiosis dan translokasi diantara genom dalam poliploid dan hibrida. Penggunaan FISH pada variasi somaklonal sangat membantu dalam mengidentifikasi dan mengerti perubahan kromosom selama proses kulur jaringan

Namun, masih terdapat keterbatasan pada teknik-teknik ini. mFISH hanya dapat digunakan dengan baik apabila setidaknya diketahui nenek moyang spesiesnya. Selain itu, mFISH juga kurang sensitif dan menggambarkan tingkatan resolusi yang lebih rendah dibandingkan FISH.

DAFTAR PUSTAKA

Devi, J., J. M. Ko, B. B. Seo. 2005. FISH and GISH: Modern cytogenetic techniques.

Fluorescent in situ fluorescence in situ hybridization of plant chromosomes: illuminating the Musa genome. INIBAP Annual Report. Montpellier. P.26-29. Indian Journal of Biotechnology. 4:307-315.

Jiang, J. and B. S. Gill. 2006. Current status and the future of hybridization (FISH) in plant genome research. GENOME. 49:1057-1068.

Kato, A., J. M. Vega, F. Han, J. C. Lamb, and J. A. Birchler. 2005. Advances in plant chromosome identification and cytogenetic techniques. Current Opinion in Plant Biology. 8:148-154.

Lusiyanti Y., I. Indrawati, dan S. Purnami. 2006. Pengenalan teknik FISH untuk deteksi aberasi kromosom translokasi akibat radiasi pengion. Buletin Alaura. 8 (2) : 53–63.

McFadden, G. I. 1995. In situ hybridization. Methode in Cell Biology. 49:165-184.

Moter, A. And U. B. Gobel. 2000. Invited rewiew Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. Journal of Microbiological Methods. 41:85-112.

Mukai Y., T. R. Endo, and B. S. Gill. 1990. Physical mapping of the 5S rRNA multigene family in common wheat. The Journal of Heredity. 81(4):290-295

Tinggalkan Balasan

Alamat email Anda tidak akan dipublikasikan. Ruas yang wajib ditandai *