Usaha budidaya udang sangat rentan terhadap terjangkitnya virus yang dapat mengancam kesuksesan dari usaha budidaya udang windu (P. monodon)  dan udang vannamei (L. vannamei). Virus yang biasa menjangkit udang windu dan vannamei tersebut meliputi White Spot Syndrome Virus (WSSV) dan juga Taura Syndrome Virus (TSV). White Spot Syndrome Virus (WSSV) pertama kali dideteksi menginfeksi pada udang windu, sedangkan Taura Syndrome Virus (TSV) pertama kali menginfeksi pada udang vannamei. Pada tulisan kali ini saya akan membahas bagaimana deteksi atas infeksi Taura Syndrome Virus dengan metode Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

Penyakit TSV telah menyebar melalui broodstock yang terinfeksi di seluruh Amerika dan Asia Tenggara, menyebabkan kerugian besar pada industri akuakultur udang pada sepuluh tahun terakhir. TSV diketahui menyebabkan mortalitas tingggi pada L. vannamei, dan P. monodon. Infeksi TSV menyebabkan 60–90% mortalitas pada L. vannamei. Udang yang survive dapat terinfeksi secara kronis, namun belum menunjukkan adanya gejala.

Hal tersebut sangatlah merugikan bagi para petani tambak yang sedang melakukan budidaya udang ini, karena infeksi kronis TSV ini baru akan dapat dilihat saat udang telah dewasadan mendekati masa panen yang dapat menyebabkan kerugian besar bagi petani tambak udang windu dan vannamei. Oleh karena itu pemerintah telah mencanangkan program karantina terhadap ikan yang akan beredar ke petani-petani agar meminimalisir dampak yang terjadi nantinya. Hal ini seperti yang telah dilakukan di Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu, dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Surabaya  I yang telah melakukan deteksi dini terhadap infeksi TSV pada anakan udang (benur/naupli) dan juga indukan yang akan menghasilkan anakan-anakan udang baru menggunakan metode Polymerase Chain reaction (PCR) dan juga menggunakan metode preparasi Histologis.

Metode PCR memiliki banyak keunggulan dari pada preparasi histologis karena deteksi PCR ini mudah dilakukan dan dapat mendeteksi terjangkitnya virus TSV ini mulai dari tingkat naupli dan benur udang. Sedangkan preparasi histologis hanya dapat digunakan untuk udang dewasa saja agar dapat dilakukan preparasi.

Metode PCR yang digunakan untuk deteksi TSV adalah dengan menggunakan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Digunakan metode ini karena genom atau materi genetik dari virus TSV adalah berupa RNA. Metode ini pada dasarnya sama dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) pada umumnya. Namun sebelum dilakukan proses PCR perlu dilakukan Reverse Transkripsi untuk mendapatkan complement DNA (cDNA) dari cetakan RNA yang ada pada genom virus TSV.

METODE DETEKSI

Pertama kali yang perlu dilakukan adalah preparasi sampel udang windu dan vannamei yang akan diuji. Preparasi ini dilakukan dengan mengambil beberapa benur udang ke dalam mikrotube 1,5 ml, atau jika berupa indukan maka yang diambil adalah pada bagian insang dan pleopod atau kaki renang. Setelah diambil, dilakukan penggerusan didalam mikrotube dengan spatula. Ditambahkan 500 ul (baca: mikro liter) RNA extraction Solution dan diinkubasi selama 5 menit kemudian divortex. Setelah inkubasi ditambahkan 100 ul Chloroform, kemudian divortex selama 20 detik. Sampel disentrifus 12.000 rpm selama 15 menit pada suhu 28 °C. Hasil dari sentrifus diambil supernatannya sebanyak 200 ul dan dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml baru. Kemudian ditambahkan 200 ul isopropanol, divortex singkat, dan disentrifus 12.000 rpm selama 10 menit. Hasil dari sentrifus dibuang supernatannya, kemudian ditambahkan etanol 75%, dan disentrifus 9.000 rpm selama 5 menit. Hasil sentrifus dibuang supernatannya dan pelet yang mengendap dikeringkan. Setelah pelet kering ditambahkan dengan 500 ul cairan DEPC (Diethyl Pyrocarbonat) untuk sampel benur dan 200 ul cairan DEPC untuk sampel insang, kemudian divortex singkat. Sampel yang terekstraksi selanjutnya dinamakan template. Template dapat langsung dilakukan amplifikasi dan dapat juga disimpan terlebih dahulu pada suhu -22 °C.

Selanjutnya dilakukan amplifikasi, yaitu perbanyakan fragmen DNA dari template yang telah diekstrak. Amplifikasi ini menggunakan primer khusus TSV bermerek dagang IQ2000 dengan sequence F 5’–AAGTAGACAGCCGCGCTT–3’ dan R 5’–TCAATGAGAGCTTGGTCC–3’. Primer tersebut dapat mendeteksi keberadaan genom virus TSV yang mungkin terkandung pada udang windu dan vannamei yang diuji.

Seluruh prosedur kerja dilakukan di dalam Cabinet Laminar Air Flow. Pertama disiapkan reagent RT-PCR, template hasil ekstraksi, dan positif kontrol TSV. Diambil 7 ul RT-PCR Pre Mixed Reagent, 0,5 ul IQzyme DNA Polymerase 2 unit/ul, dan 0,5 ul RT enzyme mix dimasukkan ke dalam mikrotube. Kemudian ditambahkan dengan 2 ul RNA template hasil ekstraksi ke dalam mikrotube 200 ul. Hasil campuran diputar dengan spin down beberapa detik kemudian diletakkan di dalam Thermocycler dan siap dilakukan amplifikasi. Thermocycler diatur suhu Preheating dengan urutan 42 °C selama 30 menit, 94°C selama 2 menit. Kemudian dilanjut ke step pertama amplifikasi yang meliputi denaturasi pada suhu 94 °C selama 20 detik, annealing pada suhu 62 °C selama 20 detik, dan extention pada suhu 72 °C selama 30 detik. Pada reaksi RT-PCR amplifikasi berjalan sebanyak 15 step. Setelah 15 step dilalui mikrotube
diambil.

Setelah selesai amplifikasi RT-PCR perlu dilanjutkan dengan reaksi Nested PCR dengan menambahkan Nested PCR pre mix sebanyak 14 ul dan IQzyme DNA Polymerase (1 ul) pada mikrotube 0,2 ml yang telah teramplifikasi dengan RT-PCR. Kemudian dimasukkan ke dalam thermocycler dengan pengaturan suhu tiap step yaitu denaturasi pada suhu 94 °C selama 20 detik, annealing pada suhu 62 °C selama 20 detik, dan extention pada suhu 72 °C selama 30 detik. Pada Nested PCR ini reaksi berjalan selama 30 step. Pada akhir reaksi setelah 30 step dilalui thermocycler diatur dengan suhu 72 °C selama 30 detik.

Seluruh prosedur kerja elektroforesis dilakukan di dalam Cabinet Laminar air Flow. Pertama disiapkan agarose TBE yang telah padat di susun dengan susunan well ada pada bagian kutub negatif elektroforesis. Dituang 500 ml larutan TBE 1x ke dalam tangki elektroforesis sampai agarose tergenang oleh larutan.

Disiapkan amplikon hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) yang akan dielektroforesis dan dicatat urutannya. Parafilm diletakkan pada meja Laminar Air Flow dan diratakan. Loading Dye diambil sebanyak 2 ul dan diteteskan pada parafilm sebanyak sampel yang akan di elektroforesis. Kemudian diambil 8 ul amplikon dan diteteskan pada salah satu tetesan Loading dye dan dilakukan repipeting untuk menghomogenkan. Jika yang diambil adalah marker 100 bp maka diambil 2 ul marker 100 bp dan 4 ul ddH2O dan diteteskan pada salah satu tetesan Loading dye. Amplikon dan Loading dye yang telah tercampur dituang sebanyak 10 ul ke dalam well atau sumur elektroforesis. Dilakukan pengulangan sampai sejumlah sampel yang akan dielektroforesis.

Setelah siap maka tutup tangki elektroforesis dipasang. Power Supply yang dihubungkan dengan Voltage Stabilizer diatur voltase 120 volt dinyalakan. Dengan demikian proses elektroforesis telah berjalan. Ditunggu hingga 45 menit atau warna indikator Loading dye telah mencapai ¾ dari medium.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan pengamatan pada UV transiluminator. Medium elektroforesis diletakkan didalam UV transiluminator dan diamati pada layar monitor yang terhubung dengan UV doc. Kemudian diamati perpendaran dari hasil elektroforesis. Terakhir dilakukan dokumentasi dengan cara dicetak dengan printer atau dengan kamera foto.

HASIL

Hasil yang diperoleh dari deteksi TSV Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu, dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Surabaya I pada tanggal 10 Februari 2012 adalah

dari hasil tersebut dapat dilihat pada sampel dengan nomor sampel 501a/B TSV (benur windu) dan reekstrak TSV. DNA sampel yang telah diamplifikasi dielektroforesis. Dari hasil elektroforesis dapat dilihat bahwa sampel tersebut negatif TSV (tidak terinfeksi TSV). Hal ini dapat dilihat dari lane nomor 7, dan 8 yang mengandung molekul DNA sampel tidak terdapat band yang sejajar dengan band yang terdapat pada lane nomor 6 yang mengandung DNA TSV (kontrol positif TSV).

Sampel dikatakan positif jika terdeteksi adanya 3 buah band DNA pada 295 bp, 490 bp, dan 680 bp. Sedangkan sampel bisa dikatakan positif ringan jika terdeteksi band DNA pada 295bp. Jika hanya terdeteksi pada band 680 bp maka sampel bisa dikatakan negatif dari serangan virus TSV.

Positif TSV

Dari pengujian yang telah dilakukan tersebut yang dicontohkan oleh sampel tanggal 10 Februari 2012 dapat disimpulkan bahwa hasil deteksi adalah negatif terhadap serangan virus TSV. Sehingga sampel tersebut akan segera mendapatkan sertifikasi dari BKI untuk dapat diedarkan kepada petani-petani tambak udang karena telah aman untuk dibudidayakan.

Ditulis oleh:

M. Ainul Mahbubillah (Mahasiswa Jurusan Biologi Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya angkatan 2009)

Hasil kerja praktek bidang Biologi Molekuler di bawah bimbingan :

  • Ir. Sri Nurhatika M.P., dosen Jurusan Biologi Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya.
  • Ir. Endang Retnowati, EP. dan Moh. Fathoni, A.Md dari Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu, dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Surabaya I.

Tinggalkan Balasan

Alamat email Anda tidak akan dipublikasikan. Ruas yang wajib ditandai *