Malaria yang disebabkan oleh genus Plasmodium telah menjadi penyakit yang mengancam kehidupan selama ribuan tahun. Lebih dari 380 juta kasus malaria setiap tahun dan lebih dari 1 juta meninggal, berdasarkan laporan dari World Health Organization (WHO, 2006).

Obat tradisional antimalaria telah menemui masalah serius dalam resistensi obat. Pada tahun 1970 an, ilmuwan China menemukan obat antimalaria baru yang efektif yaitu artemisinin, yang diekstrak dari tanaman obat herbal tradisional China Artemisia annua L. (Collaboration research group for Qinghaosu, 1979). Artemisinin aktif dalam melawan semua spesies Plasmodium.

Artemisinin dan derivatnya, disalurkan dalam bentuk artemisinin-based combination therapies (ACTs), yang sekarang menjadi pilihan paling baik untuk penanganan malaria (WHO, 2006). Disamping aktivitas antimalaria, artemisinin juga mempunyai aktivitas antivirus, anti kanker, dan antischistosomal (Arsenault et al., 2008). Namun disayangkan bahwa kandungan artemisinin pada A. annua masih rendah, berkisar antara 0.01 hingga 1.0% berat kering, yang menghasilkan biaya yang relatif tinggi untuk penanganan berbasis artemisinin. Hal ini merupakan masalah yang serius untuk orang yang kurang mampu pada negara berkembang dimana malaria sering terjadi. Oleh karena itu, beberapa usaha telah dilakukan untuk meningkatkan produksi dari artemisinin, meliputi kemosintesis, kultur sel dan jaringan, rekayasa genetika tanaman, biologi sintetik, dan persilangan dari tanaman penghasil artemisinin tinggi (Covello, 2008; Graham et al., 2010; Liu et al., 2011). Produksi berbasis yeast dari artemisinic acid, yang dapat dikonversi menjadi artemisinin dengan hasil yang relatif bagus (40–45%), telah dikembangkan sebelumnya (Paddon et al., 2013). Proses ini telah diperluas dan produksi artemisinin secara komersia telah diumumkan oleh Sanofi Aventis (http://www.path.org/news/press-room/422/). Produksi tahunan harus mencapai sekitar 50–60 ton artemisinin, yang meskipun jumlah tersebut belum cukup untuk mengatasi kebutuhan obat ini. Oleh karena itu, tanaman tetap akan menjadi sumber penting untuk artemisinin.

Gambar 3. Jalur biosintetik artemisinin.

Pada satu dekade terakhir, terdapat kemajuan signifikan dalam menguraikan jalur biosintesis artemisinin (Gambar 1). Artemisinin disintesis melalui jalur metabolik isoprenoid. Siklisasi dari farnesyl diphosphate menjadi amorpha-4,11-diene oleh amorpha-4,11-diene synthase (ADS) adalah langkah awal dalam biosintesis artemisinin (Bouwmeester et al., 1999; Mercke et al., 2000; Wallaart et al., 2001). Pada langkah selanjutnya, cytochrome P450 yang bergantung pada amorpha-4,11-diene 12-hydroxylase (CYP71AV1) mengkatalisis oksidasi dari amorpha-4,11-diene untuk memproduksi artemisinic alcohol, yang teroksidasi menjadi artemisinic aldehyde oleh CYP71AV1 dan/atau alcohol dehydrogenase 1 (ADH1) (Paddon et al., 2013; Teoh et al., 2006). Kemudian, artemisinic aldehyde direduksi menjadi dihydroartemisinic aldehyde dengan artemisinic aldehyde D11(13) reductase (DBR2) dan kemudian dioksidasi menjadi dihydroartemisinic acid dengan aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) (Teoh et al., 2009; Zhang et al., 2008). Jalur biosintetik artemisinin bercabang dan intermediet artemisinic aldehyde dapat dioksidasi menjadi artemisinic acid oleh CYP71AV1 dan/atau ALDH1 (Teoh et al., 2006, 2009). Intermediet dihydroartemisinic acid dikonversi menjadi artemisinin dan artemisinic acid dikonversi menjadi arteannuin B, pada reaksi non enzimatik (Brown, 2010).

Upaya untuk meningkatkan produksi Artemisinin

Semua gen yang mengkode enzim yang disebutkan di atas telah dikloning dan rekayasa genetika dari A. annua menjadi pendekatan yang paling menjanjikan untuk meningkatkan hasil produksi artemisinin. Overekspresi dari Gossypium arboretum atau A. annua farnesyl diphosphate synthase (FDS) pada tanaman A. annua meningkatkan kandungan artemisinin (dari 0.3 hingga 0.9–1.0% berat kering) (Chen et al., 2000; Han et al., 2006). Overekspresi dari ADS pada tanaman A. annua meningkatkan kandungan artemisinin, dihydroartemisinic acid, dan artemisinic acid sekitar 100%, 59%, 65%, dan kandungan mutlak dari artemisinin adalah 0.9–1.0% berat kering (Ma et al., 2009a). Pada tanaman transgenik A. annua dengan HMGR teroverkspresi sendiri atau bersama dengan ADS, kandungan artemisinin meningkat 1.22- dan 6.65- kali lipat, dibandingkan dengan line non transgenik (kandungan artemisinin 0.02% berat kering) (Alam and Abdin, 2011; Aquil et al., 2009). Pada tanaman transgenik A. annua yang teroverekspresi pada gen CYP71AV1 dan cytochrome P450 reductase (CPR) menghasilkan kandungan artemisinin yang meningkat 38% dibandingkan dengan line tanaman non transgenik A. annua (700 μg/g berat basah) (Shen et al., 2012).

Sejak banyaknya enzim yang terlibat dalam biosintesis, sangat baik untuk melakukan upregulasi pada aktivitas enzim biosintetik artemisinin secara bersama-sama untuk meningkatkan sintesis artemisinin secara efisien. Sintesis artemisinin didukung oleh jasmonate (JA) dan salicylic acid (SA) (Maes et al., 2011; Pu et al., 2009). Level transkripsi FDS, ADS, CYP71AV1, DBR2, dan CPR dapat meningkat ketika tanaman A. annua diberi perlakuan dengan JA (Maes et al., 2011). Hal ini mengindikasikan bahwa jaringan kontrol transkripsional berperan dalam biosintesis artemisinin. Faktor transripsi memainkan peranan penting dalam mengontrol transkrips dari gen biosintetik dan merupakan mekanisme utama yang meregulasi metabolit sekunder pada tanaman (Endt et al., 2002).

Telah dilaporkan bahwa faktor transkripsi WRKY dan faktor transkripsi AP2/ERF terlibat dalam sintesis artemisinin (Lu et al., 2013; Ma et al., 2009b; Yu et al., 2011). Familia WRKY termasuk di antara sepuluh familia terbesar dari faktor transkripsi pada tanaman tingkat tinggi. Faktor transkripsi ini membawa domain WRKY yang merupakan peregangan 60 asam amino yang mengandung rangkaian asam amino yang lestari WRKYGQK bersama dengan zinc-finger like motif. Protein WRKY secara khusus mengikat elemen cis-acting DNA, yaitu W-box (TTGACC/T) untuk melakukan fungsi biologisnya. Protein WRKY terlibat dalam meregulasi respon pertahanan dan proses perkembangan dan fisiologis tanaman, seperti inisiasi trikhoma, penuaan, dan metabolisme (Rushton et al., 2010). Pada Arabidopsis, sinyal MPK3/MPK6 mengarah langsung pada fosforilasi AtWRKY33 dan kemudian protein WRKY yang terfosforilasi mengikat promotor PAD3, yang mengkodekan enzim P450 (CYP71B15) yang merupakan tahap terakhir biosintesis camalexin, sebuah phytoalexin utama pada Arabidopsis thaliana (Mao et al., 2011). CjWRKY1 yang dikloning dari Coptis japonica, memainkan peran spesifik dan komprehensif dalam jalur biosintesis benzilisoquinoline alkaloid (Kato et al., 2007). CrWRKY1 secara positif mengatur biosintesis terpenoid indole alkaloid pada Catharanthus roseus (Suttipanta et al., 2011). Pada tanaman kapas, faktor transkripsi GaWRKY1 mengaktifkan transkripsi gen seskuiterpen sintase (+)-δ-cadinene synthase-A (CAD1-A) dengan cara berinteraksi dengan elemen W-box dari promotor CAD1-A (Xu et Al., 2004).

AaWRKY1 diisolasi dari perpustakaan cDNA dari glandular secretory trichomes (GST) A. annua; Protein AaWRKY1 mampu mengikat elemen W-box; Ekspresi transien cDNA AaWRKY1 pada daun A. annua mengaktifkan ekspresi ADS, CYP71AV1 dan DBR2 (Ma et al., 2009b). Penelitian terbaru pada sekuens nukleotida pada promoter menunjukkan bahwa ada dua W-box yang dapat diprediksi pada masing-masing promoter DBC2 (Ma et al., 2009b; Wang et al., 2011), CYP71AV1 (Wang et al., 2013), dan DBR2 (Tidak dipublikasikan). Oleh karena itu, sangat menarik untuk melakukan overekspresi AaWRKY1 pada tanaman A. annua yang bertransformasi secara stabil untuk mengeksplorasi lebih lanjut fungsi AaWRKY1 dan untuk memperbaiki biosintesis artemisinin.

Biosintesis artemisinin telah diusulkan untuk ditempatkan pada glandular secretory trichomes (GST) dari A. annua sejak enzim biosintesis artemisinin, yaitu ADS, CYP71AV1, DBR2 dan ALDH1, diekspresikan sangat tinggi dalam GST (Olsson et al., 2009; Teoh et al., 2006; Teoh et al., 2009; Zhang et al., 2008; Wang et al., 2011, 2013). Kelompok penelitian sebelumnya telah mengkloning promotor CYP71AV1, yang sangat aktif khususnya di GST (Wang et al., 2013). Hal tersebut dapat menjadi promotor yang sangat baik untuk rekayasa metabolik biosintesis artemisinin pada GST.

Peningkatan ekspresi AaWRKY1 pada biosintesis Artemisinin

Dalam penelitian yang dilakukan oleh Han et al., 2014, yang berjudul Effects of overexpression of AaWRKY1 on artemisinin biosynthesis in transgenic Artemisia annua plants, AaWRKY1 dikloning dari A. annua var. Chongqing dan dioverekspresikan secara stabil dalam tanaman transgenik A. annua. Promoter CaMV35S dan CYP71AV1 masing-masing digunakan untuk mengekspresikan gen AaWRKY1 secara konstitutif atau trikomis secara khusus. Efek dari ekspresi berlebih pada AaWRKY1 pada biosintesis artemisinin diselidiki untuk mengeksplorasi fungsi AaWRKY1 secara in vivo dan mekanisme regulasi biosintesis artemisinin.

AaWRKY1 dikloning dari strain tanaman A. annua penghasil artemisinin tinggi (Ma et al., 2009b). Dalam penelitian ini, satu gen WRKY diklon dari A. annua var. Chongqing, menggunakan primer yang dirancang sesuai sekuens nukleotida AaWRKY1. Open reading frame dari gen WRKY mengandung 936 bp dan mengodekan protein dengan 311 asam amino (GeneBank Accession No. KC118517). Alignment sekuens nukleotida AaWRKY1 (FJ390842) dan gen kloning WRKY menunjukkan bahwa ada 21 situs perbedaan di antara keduanya. Alignment protein menunjukkan bahwa ada 9 asam amino yang berbeda antara dua protein; namun motif WRKY dan residu asam amino yang membentuk zinc finger tetap lestari (Gambar 2).

Meskipun ada 9 substitusi asam amino di antara sekuens asam amino yang hasilkan dari gen WRKY dan AaWRKY1 yang baru dikloning, homologi antara kedua gen tersebut lebih dari 97% dan motif WRKY dan residu asam amino yang membentuk zinc finger identik. Oleh karena itu, disimpulkan bahwa keduanya adalah alel dari gen yang sama dari ekotipe yang berbeda dari A. annua.

Gambar 2. Alignment sekuens asam amino AaWRKY1 (FJ390842) dan kloning AaWRKY1. Residu asam amino di dalam kotak abu-abu merupakan motif WRKY dan asam amino dalam kotak hitam membentuk zinc finger.

Analisa molekular dari transgenik A. annua

Delapan line transgenik A. annua dianalisa dengan PCR dan Southern blot. Fragmen amplifikasi PCR berukuran 686 bp saat primer NPTII digunakan. Hasil analisa PCR menunjukkan bahwa ada satu pita dengan ukuran yang tepat di setiap lane tanaman transgenik dan kontrol positif, sementara tidak ada produk amplifikasi pada lane tanaman wild-type (Gambar 3). Dengan menggunakan primer kloning WRKY, panjang gen AaWRKY1 yang teramplifikasi adalah 950 bp. Hasil analisa PCR menunjukkan bahwa ada satu pita amplifikasi dengan ukuran yang tepat di setiap lane tanaman transgenik dan kontrol positif, sementara tidak ada produk amplifikasi di jalur tanaman wild-type (Gambar 1). Namun, pita lemah lainnya yaitu sekitar 1200 bp, diamati pada semua sampel tanaman termasuk tanaman wild type (Gambar 1). Band ini kemungkinan besar diamplifikasi dari gen AaWRKY1 endogen yang membawa beberapa intron.

Gambar 3. Analisa PCR dari tanaman transgenik menggunakan primer NPTII dan AaWRKY1. Fragmen target dari gen NPTII dan AaWRKY1 adalah 686 dan 950 bp, dibandingkan dengan M: marker DNA; CYP-1, CYP-2, CYP-3, CYP-4: empat line transgenik yang ditransformasi menggunakan pCAMBIA-1381Z-M::pCYP::AaWRKY1; 35S-1, 35S-2, 35S-3, 35S-4: empat line transgenik yang ditransformasi menggunakan pCAMBIA-1381Z-M::p35S::AaWRKY1; wt: wild-type A. annua; plasmid: kontrol positif yang merupakan template vector pCAMBIA-1381Z-M::p35S::AaWRKY1.

Analisa Southern blot dilakukan dengan menggunakan probe 686-bp untuk gen NPTII. Seperti ditunjukkan pada Gambar 4, ada satu kelompok hibridisasi kuat dari fragmen gen NPTII di lane kontrol positif sementara tidak ada sinyal di lane tanaman wild type. Ada satu pita hibridisasi pada lane line transgenik 35S-1, 35S-3, CYP-1, CYP-2, CYP-3 dan CYP-4, sementara ada banyak band di lane transgenik 35S-2 Dan 35S-4. Hasil PCR dan Southern blot menunjukkan bahwa gen eksogen (yaitu gen AaWRKY1 dan gen NPTII) diintegrasikan ke dalam genom A. annua. EcoRI digunakan untuk mencerna DNA genom karena ada satu situs restorasi EcoRI yang unik di daerah T-DNA vektor pCAMBIA, yang digunakan dalam penelitian ini. Dalam kasus ini, jumlah pita hibridisasi sebagian besar identik dengan jumlah salinan gen eksogen. Sejauh transformasi tanaman melalui metode transformasi berbasis Agrobacterium tumefaciens diperhatikan, maka tanaman akan mungkin untuk mendapatkan tanaman transgenik single-copy. Di antara tanaman transgenik yang dianalisa, ada 6 lane single copy dan 2 lane multi copy (Gambar 6). Di lane 35S-2, tampak ada empat fragmen restriksi, namun intensitas sinyal hibridisasi jelas berbeda, yaitu dua pita dengan sinyal kuat dan dua pita dengan sinyal lemah. Dua pita lemah kemungkinan berasal dari fragmen yang sebagian dicerna dan oleh karena itu kemungkinan besar tidak mewakili salinan transgenik.

Gambar 4. Analisa Southern blot dari tanaman transgenik menggunakan probe NPTII. DNA Genomik (15 μg) dicerna dengan with EcoRI. Plasmid: plasmid pCAMBIA-1381Z-M dicerna oleh XhoI untuk mendapatkan fragmen gen NPTII 882 bp; wt: wild-type A. annua; 35S-1, 35S-2, 35S-3, 35S-4: empat line transgenik yang ditransformasi dengan pCAMBIA-1381Z-M::p35S::AaWRKY1; CYP-1, CYP-2, CYP-3, CYP-4: empat line transgenik yang ditransformasi dengan pCAMBIA-1381Z-M::pCYP::AaWRKY1.

Pengaruh overekspresi AaWRKY1 pada level transkripsi enzim yang terlibat dalam biosintesis artemisinin

Level transkripsi AaWRKY1, FDS, ADS, CYP71AV1 dan DBR2 dianalisa menggunakan qPCR. ALDH1 juga dianalisa namun nilai Ct lebih rendah dari 35 atau tidak terdeteksi. Pada tanaman transgenik, tingkat transkripsi AaWRKY1 meningkat secara dramatis, yaitu lebih dari seratus kali di bawah kendali promoter CaMV35S dan sekitar 40 kali di bawah kendali promotor CYP71AV1, dibandingkan dengan tingkat transkripsi AaWRKY1 pada tanaman tipe liar (Gambar 5). Pada tanaman transgenik, tingkat transkripsi CYP71AV1 meningkat, terutama bila gen AaWRKY1 secara khusus dioverekspresi pada GST namun tingkat transkripsi FDS, ADS, dan DBR2 tidak berubah secara signifikan (Gambar 5).

Gambar 5. Ekspresi relatif dari gen target pada daun muda tanaman transgenik A. annua dibandingkan dengan daun muda pada tanaman wild-type. wt: wild-type A. annua; Line transgenik: 35S-1, 35S-2, 35S-3, 35S-4 (AaWRKY1 dioverekspresi menggunakan promoter CaMV35S); CYP-1, CYP-2, CYP-3, CYP-4(AaWRKY1 dioverekspresi menggunakan promoter CYP71AV1).

Promotor kloning CYP71AV1 mampu mengaktifkan transkripsi gen secara khusus di GST dan terlebih lagi promotor ini lebih aktif daripada promotor CYP71AV1 pada wild type (Wang et al., 2013). Hasil kami menunjukkan bahwa promotor CYP71AV1 yang dikloning adalah promotor efektif untuk rekayasa metabolik biosintesis artemisinin. Level transkripsi tertinggi AaWRKY1 di bawah kendali promotor CYP71AV1 adalah 40 kali lebih tinggi dari tanaman wild type (Gambar 5). Selain itu, overekspresi AaWRKY1 yang spesifik pada GST meningkatkan level transkripsi CYP71AV1 hingga 32 kali, sementara itu hanya sampai 4 kali dalam overekspresi konstitutif pada AaWRKY1. Ada dua W-box GGTCAA pada promoter CYP71AV1 (Wang et al., 2013). Protein AaWRKY1 mampu mengikat elemen cis-acting W-box GGTCAA yang dianalisa dengan electrophoretic mobility shift assay dan ekspresi transien cDNA AaWRKY1 pada daun A. annua mengaktifkan ekspresi CYP71AV1 (sekitar 3 kali lipat) (Ma et Al., 2009b). Hal ini sangat menarik untuk dicatat overekspresi AaWRKY1 yang spesifik pada GST jauh lebih efektif daripada efek overekspresi AaWRKY1 yang konstitutif. Dari Gambar 7, jelas bahwa ekstrak dari tanaman yang mengoverekspresi AaWRKY1 secaara konstitutif mengandung transkripsi AaWRKY1 3-4 kali lebih banyak dari pada tanaman yang secara khusus melakukan overekspresi AaWRKY1 pada GST. Namun, jumlah sel trichome hanya sebagian kecil dari jumlah sel dalam daun.

Sebagai akibatnya, konsentrasi transkripsi AaWRKY1 pada sel jauh lebih tinggi pada GST tanaman yang secara khusus melakukan overekspresi AaWRKY1 pada trikoma dari pada di GST tanaman yang melakukan overekspresi AaWRKY1 secara konstitutif. Perbedaan konsentrasi ini mungkin menjadi alasan bagi level transkripsi CYP71AV1 yang lebih tinggi yang diamati ketika gen AaWRKY1 secara khusus dioverekspresi pada GST. Secara jelas, transkripsi gen CYP71AV1 tidak dapat diinduksi secara efektif pada jenis sel lain dengan overekspresi AaWRKY1. Selain itu, sangat mungkin bahwa protein spesifik GST lainnya dapat bekerja sama dengan AaWRKY1 dalam regulasi gen CYP71AV1. Telah ditetapkan bahwa faktor transkripsi WRKY meregulasi ekspresi gen melalui koordinasi dengan DNA-binding atau non-DNA-binding interacting proteins lainnya (Rushton et al., 2010). Dalam sebuah laporan baru-baru ini, ditunjukkan bahwa AaORA, faktor transkripsi AP2 / ERF spesifik GST yang dikloning dari A. annua, meng-upregulasi biosintesis artemisinin. Pada tanaman transgenik A. annua di mana AaORA dioverekspresi, tingkat transcipsi CYP71AV1 meningkat 5-17 kali (Lu et al., 2013). AaORA spesifik GST cenderung bekerja sama dengan AaWRKY1 untuk meningkatkan ekspresi CYP71AV1.

Overekspresi AaWRKY1 tidak meningkatkan tingkat transkripsi FDS pada A. annua. Hasil ini sesuai dengan laporan lain, yang menunjukkan bahwa tingkat transkrip FDS tidak meningkat saat AaWRKY1 dioverekspresikan pada daun A. annua (Ma et al., 2009b). FDS mengkatalisis biosintesis farnesyl difosfat, yang merupakan prekursor untuk berbagai terpenoid seperti seskuiterpen dan sterol (Gambar 3). Familia gen kecil mengkode isozim FDS pada tanaman. Pada Arabidopsis thaliana, FDS1 adalah house-keeping gene yang diekspresikan di semua jaringan pada semua tahap perkembangan dan diperkirakan terlibat dalam sintesis isoprenoid yang berfungsi untuk fungsi dasar sel tumbuhan seperti produksi sterol untuk berbagai membran (Cunillera et al., 2000). FDS2 biasanya indusibel dan ditemukan pada jaringan khusus pada tahap perkembangan tertentu dan diperkirakan terlibat dalam sintesis isoprenoid tertentu dengan fungsi khusus (Cunillera et al., 2000).

Homologi antara FDS1 dan FDS2 pada tanaman familia Asteraceae adalah 82,0% hingga 89,7% (Tabel 1S). Gen FDS1 dan FDS2 dikloning dari Artemisia tridentata ssp. Spiciformis menunjukkan identitas sekuens asam amino 83%. FDS1 memiliki aktivitas spesifik yang lebih tinggi dari pada FDS2 dan tingkat transkripsi FDS1 20 kali lipat lebih tinggi daripada FDS2 pada tunas (Hemmerlin et al., 2003). Sekuens nukleotida dari dua gen FDS dari A. annua yang ditunjuk sebagai FDS1 dan FDS2 dapat ditemukan di GenBank. Namun, region pengkode kedua gen ini menunjukkan identitas sekuens nukleotida 96,6%. Sebuah analisa filogenetik gen FDS dari familia Asteraceae menunjukkan bahwa kedua gen AaFDS sebenarnya mewakili house-keeping FDS1 seperti yang disarankan oleh Hemmerlin et al. (2003) (Gambar 3). Primer qPCR yang digunakan dalam penelitian ini dapat mendeteksi jumlah total transkripsi gen AaFDS1 dan gen indusibel AaFDS2. AaWRKY1 dapat mengatur transkripsi FDS2 indusibel namun karena gen ini belum dikloning dari A. annua, kita tidak dapat secara selektif mempelajari ekspresinya.

Terdapat dua dugaan W-box pada promoter ADS (Wang et al., 2011) dan DBR2 (tidak dipublikasikan). Namun, tidak ada perbedaan yang signifikan antara tingkat transkrip ADS dan DBR2 antara tanaman transgenik dan wild type. Famila WRKY adalah satu dari sepuluh familia faktor transkripsi terbesar pada tanaman tingkat tinggi. Diperkirakan ada lebih dari 70 protein WRKY dalam Arabidopsis dan 100 protein WRKY pada Oryza sativa. Familia WRKY dibagi menjadi tiga kelompok berdasarkan jumlah domain WRKY (dua domain pada protein kelompok I dan satu domain pada dua kelompok lainnya) dan struktur zinc finger (C2HC pada Kelompok III dan C2H2 pada kelompok lain) (Rushton et Al., 2010). W-box (TTGAC(C/T)) adalah konsensus minimal yang diperlukan untuk mengikat protein WRKY namun sekuens nukleotida yang bersebelahan dengan W-box menentukan kekuatan dan spesifisitas pengikatan DNA (Ciolkowski et al., 2008). Kemungkinan nukleotida mengapit dari W-box tidak optimal pada promotor ADS dan DBR2, dan oleh karena itu AaWRKY1 tidak dapat mengaktifkannya secara efektif. Sekuens asam amino AaWRKY1 menunjukkan identitas 15,9% dengan GaWRKY1, yang mengaktifkan transkripsi gen sesquiterpene synthase (+)-δ-cadinene synthase-A (CAD1-A) dengan cara berinteraksi dengan W-box dari promoter CAD1-A (Ma et al., 2009b; Xu et al., 2004). AaWRKY1 termasuk dalam familia WRKY kelompok III sementara GaWRKY1 termasuk dalam kelompok II. Kloning gen AaWRKY lain, yang termasuk dalam familia WRKY kelompok II dan menunjukkan 47,5% homologi dengan GaWRKY1 baru saja dilaksanakan. Saat ini, transformasi tanaman pada gen WRKY ini masih dilaksanakan di laboratorium.

Kandungan artemisinin dan dihydroartemisinic acid pada tanaman transgenik A. annua

Tanaman transgenik A. annua menunjukkan karakter morfologi identik dengan jenis wild-type dan tidak ada perbedaan yang signifikan antara tanaman transgenik dan jenis wild-type dalam hal kepadatan dan ukuran GST pada daun (Gambar 2). Kandungan artemisinin dalam tanaman penghasil artemisinin tinggi, yaitu A. annua var. Chongqing kira-kira 1,0% berat kering sesuai dengan hasil analisa GC-MS. Kandungan artemisinin meningkat dengan selisih yang besar dalam line transgenik CYP-1, CYP-3, CYP-4 (Gambar 6). Pada line transgenik CYP-4, di mana tingkat transkrip CYP71AV1 dan DBR2 meningkat 32 kali dan 1,8 kali, masing-masing, kandungan artemisinin sekitar 1,9 kali dibandingkan dengan tipe tanaman liar. Kandungan dihydroartemisinic acid, yang merupakan prekursor langsung artemisinin, juga ditunjukkan pada Gambar. 8. Hasil menunjukkan bahwa upregulasi CYP71AV1 mempromosikan biosintesis artemisinin.

Gambar 6. Kandungan artemisinin dan dihydroartemisinic acid pada tanaman transgenik dan wild type A. annua. wt: wild-type A. annua; line transgenik: 35S-1, 35S-2, 35S-3, 35S-4 (AaWRKY1 dioverekspresi menggunakan  promoter CaMV35S); CYP-1, CYP-2, CYP-3, CYP-4 (AaWRKY1 dioverekspresi menggunakan  promoter CYP71AV1).

References

Alam, P., Abdin, M.Z., 2011. Overexpression of HMG-CoA reductase and amorpha-4,11-diene synthase genes in Artemisia annua L. and its influence on artemisinin content. Plant Cell Rep. 30, 1919–1928.

Aquil, S., Husaini, A.M., Abdin, M.Z., Rather, G.M., 2009. Overexpression of the HMGCoA reductase gene leads to enhanced artemisinin biosynthesis in transgenic Artemisia annua plants. Planta Med. 75, 1453–1458.

Arsenault, P.R., Wobbe, K.K., Weathers, P.J., 2008. Recent advances in artemisinin production through heterologous expression. Curr. Med. Chem. 15, 2886–2896.

Bentley, R. and Haslam, E., 1990. The shikimate pathway – a metabolic tree with many branche. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25 (5), 307 – 384.References 521

Bouwmeester, H.J., Wallaart, T.E., Janssen, M.H., van Loo, B., Jansen, B.J., Posthumus, M.A., et al., 1999. Amorpha-4,11-diene synthase catalyses the first probable step in artemisinin biosynthesis. Phytochemistry 52, 843–854.

Brown, G.D., 2010. The Biosynthesis of artemisinin (Qinghaosu) and the phytochemistry of Artemisia annua L. (Qinghao). Molecules 15, 7603–7698.

Chen, D., Ye, H., Li, G., 2000. Expression of a chimeric farnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L. transgenic plants via Agrobacterium tumefaciensmediated transformation. Plant Sci. 155, 179–185.

Ciolkowski, I., Wanke, D., Birkenbihl, R.P., Somssich, I.E., 2008. Studies on DNAbinding selectivity of WRKY transcription factors lend structural clues into WRKY-domain function. Plant Mol. Biol. 68, 81–92.

Collaboration research group for Qinghaosu, 1979. Studies on new anti-malarial drug qinghaosu [in Chinese]. Yaoxue Tongbao 14, 49–53.

Covello, P.S., 2008. Making artemisinin. Phytochemistry 69, 2881–2885.

Cunillera, N., Boronat, A., Ferrer, A., 2000. Spatial and temporal patters of GUS expression directed by 50 regions of the Arabidopsis thaliana farnesyl diphosphate synthase genes FPS1 and FPS2. Plant Mol. Biol. 44, 747–758.

Endt, D.V., Kijne, J.W., Memelink, J., 2002. Transcription factors controlling plant secondary metabolism: what regulates the regulators? Phytochemistry 61, 107–114.

Ganapathy, S. 2006. Bioreactor technology: a novel industrial tool for high-tech production of bioactive molecules and biopharmaceuticals from plant roots. Biotechnol. J., 1 (12), 1419-1427.

Gómez – Galera, S., Pelacho, A., Gené, A., Capell, T., and Christou, P. 2007. The genetic manipulation of medicinal and aromatic plants. Plant Cell Rep., 26 (10), 1689 – 1715.

Graham, I.A., Besser, K., Blumer, S., Branigan, C.A., Czechowski, T., Elias, L., et al., 2010. The genetic map of Artemisia annua L. identifies loci affecting yield of the antimalarial drug artemisinin. Science 327, 328–331.

Han, J., Liu, B., Ye, H., Wang, H., Li, Z., Li, G., 2006. Effects of overexpression of the endogenous farnesyl diphosphate synthase on the artemisinin content in Artemisia annua L.. J. Integr. Plant Biol. 48, 482–487.

Han, J., Wang, H., Ye, H., Liu, Y., Li, Z., Zhang, Y., et al., 2005. High efficiency of genetic transformation and regeneration of Artemisia annua L. via Agrobacterium tumefaciens-mediated procedure. Plant Sci. 168, 73–80.

Han, Junli, Hongzhen Wang, Anneli Lundgren, Peter E. Brodelius. 2014. Effects of overexpression of AaWRKY1 on artemisinin biosynthesis in transgenic Artemisia annua plants. Phytochemistry 102 (2014) 89–96.

Hemmerlin, A., Rivera, S.B., Erickson, H.K., Poulter, C.D., 2003. Enzymes encoded by the farnesyl diphosphate synthase gene family in the Big Sagebrush Artemisia tridentata ssp. spiciformis. J. Biol. Chem. 278, 32132–32140.

Hendrawati, O., Woerdenbag, H. J., Hille, J., & Kayser, O. 2012. Metabolic Engineering of Medicinal Plants and Microorganisms for the Production of Natural Products. In O. Kayser, & H. Warzecha (Eds.), Pharmaceutical Biotechnology: Drug Discovery and Clinical Applications, Second Edition. (pp. 491-526). Weinheim, Germany

Herrmann, K.M. and Weaver, L.M. 1999. The shikimate pathway. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50 (1), 473 – 503.

Joshi, K., Chavan, P., Warude, D., and Patwardhan, B. 2004. Molecular markers in herbal drug technology. Curr. Sci., 87, 159 – 165. 5

Kato, N., Dubouzet, E., Kokabu, Y., Yoshida, S., Taniguchi, Y., Dubouzet, J.G., et al., 2007. Identification of a WRKY protein as a transcriptional regulator of benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in Coptis japonica. Plant Cell Physiol. 48, 8–18.

Koffas, M., Roberge, C., Lee, K., and Stephanopoulos, G. 1999. Metabolic engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng., 1 (1), 535 – 557.

Kumar, J. and Gupta, P. 2008. Molecular approaches for improvement of medicinal and aromatic plants. Plant Biotechnol. Rep., 2 (2), 93 – 112.

Liu, B., Wang, H., Du, Z., Li, G., Ye, H., 2011. Metabolic engineering of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.. Plant Cell Rep. 30, 689–694.

Lu, X., Zhang, L., Zhang, F., Jiang, W., Shen, Q., Zhang, L., et al., 2013. AaORA, a trichome-specific AP2/ERF transcription factors of Artemisia annua, is a positive regulator in the artemisinin biosynthesis pathway and in disease resistance to Botrytis cinerea. New Phytol. 198, 1191–1202.

Ma, C., Wang, H., Lu, X., Wang, H., Xu, G., Liu, B., 2009a. Terpenoid metabolic profiling analysis of transgenic Artemisia annua L. by comprehensive twodimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry. Metabolomics 5, 497–506. J. Han et al. / Phytochemistry 102 (2014) 89–96 95Ma, D., Pu, G., Lei, C., Ma, L., Wang, H., Guo, Y., et al., 2009b. Isolation and characterization of AaWRKY1, an Artemisia annua transcription factor that regulates the amorpha-4,11-diene synthase gene, a key gene of artemisinin biosynthesis. Plant Cell Physiol. 50, 2146–2161.

Maes, L., Van Nieuwerburgh, F.C.W., Zhang, Y., Reed, D.W., Pollier, J., Vande Casteele, S.R.F., 2011. Dissection of the phytohormonal regulation of trichome formation and biosynthesis of the antimalarial compound artemisinin in Artemisia annua plants. New Phytol. 189, 176–189.

Mao, G., Meng, X., Liu, Y., Zheng, Z., Chen, Z., Zhang, S., 2011. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell 23, 1639–1653.

Mercke, P., Bengtsson, M., Bouwmeester, H.J., Posthumus, M.A., Brodelius, P.E., 2000. Molecular cloning, expression, and characterization of amorpha-4,11-diene synthase, a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.. Arch. Biochem. Biophys. 381, 173–180.

Newman, D.J. and Cragg, G.M. 2007. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years. J. Nat. Prod., 70 (3), 461 – 477. Pharmacological and Social Aspects (eds R.J. Bogers, L.E. Craker, and D. Lange), Springer, pp. 291 – 300.

Olofsson, L., Engström, A., Lundgren, A., Brodelius, P.E., 2011. Relative expression of genes of terpene metabolism in different tissues of Artemisia annua L.. BMC Plant Biol. 11, 45–56.

Olsson, M.E., Olofsson, L.M., Lindahl, A., Lundgren, A., Brodelius, M., Brodelius, P.E., 2009. Localization of enzymes of artemisinin biosynthesis to the apical cells of glandular secretory trichomes of Artemisia annua L.. Phytochemistry 70, 1123–1128.

Paddon, C.J., Westfall, P.J., Pitera, D.J., Benjamin, K., Fisher, K., McPhee, D., et al., 2013. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature 496, 528–532.

Planta 212, 460–465. Wang, H., Olofsson, L., Lundgren, A., Brodelius, P.E., 2011. Trichome-specific expression of amorpha-4,11-diene synthase, a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L., as reported by a promoter-GUS fusion. Am. J. Plant Sci. 2, 619–628.

Pu, G., Ma, D., Chen, J., Ma, L., Wang, H., Li, G., et al., 2009. Salicylic acid activates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.. Plant Cell Rep. 28, 1127–1135.

Rushton, P.J., Somssich, I.E., Ringler, P., Shen, Q.J., 2010. WRKY transcription factors. Trends Plant Sci. 15, 247–258.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Shen, Q., Chen, Y., Wang, T., Wu, S., Lu, X., Zhang, L., et al., 2012. Overexpression of the cytochrome P450 monooxygenase (cyp71av1) and cytochrome P450 reductase (cpr) genes increased artemisinin content in Artemisia annua (Asteraceae). Genet. Mol. Res. 11, 3298–3309.

Suttipanta, N., Pattanaik, S., Kulshrestha, M., Patra, B., Singh, S.K., Yuan, L., 2011. The transcription factor CrWRKY1 possitively regulates the terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus. Plant Physiol. 157, 2081–2093.

Teoh, K.H., Polichuk, D.R., Reed, D.W., Covello, P.S., 2009. Molecular cloning of an aldehyde dehydrogenase implicated in artemisinin biosynthesis in Artemisia annua. Botany 87, 635–642.

Teoh, K.H., Polichuk, D.R., Reed, D.W., Nowak, G., Covello, P.S., 2006. Artemisia annua L. (Asteraceae) trichome-specific cDNAs reveal CYP71AV1, a cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the antimalarial sesquiterpene lactone artemisinin. FEBS Lett. 580, 1411–1416.

Terryn, N., Van Montagu, M., Inze, D., and Goosens, A. 2006. Functional genomic approaches to study and engineer secondary natural metabolism in plant cell cultures, Chapter 21, in Volume 17 Medicinal and Aromatic Plants: Agricultural, Commercial, Ecological, Legal,

Verpoorte, R. 2000. Plant secondary metabolites, in Metabolic Engineering of Plant Secondary Metabolism (eds R. Verpoorte and A.W. Alfermann), Kluwer Academic Publisher, Dodrecht, Boston, London, pp. 1 – 30.

Vines, G. 2004. Herbal harvests with a future: towards sustainable sources for medicinal plants. Plantlife International; Available at: http://www.plantlife.org.uk/uploads/documents/Herbal – Harvests – with – a – Future.pdf (accessed 23 January 2012).

Wallaart, T.E., Bouwmeester, H.J., Hille, J., Poppinga, L., Maijers, N.C., 2001. Amorpha-4,11-diene synthase: cloning and functional expression of a key enzyme in the biosynthetic pathway of the antimalarial drug artemisinin.

Wang, H., Han, J., Kanagarajan, S., Lundgren, A., Brodelius, P.E., 2013. Trichomespecific expression of the amorpha-4,11-diene 12-hydroxylase (cyp71av1) gene, encoding a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua, as reported by a promoter-GUS fusion. Plant Mol. Biol. 81, 119–138.

WHO, 2006. Guidelines for the Treatment of Malaria. Printed in Switzerland.

Xu, Y., Wang, J., Wang, S., Wang, J., Chen, X., 2004. Characterization of GaWRKY1, a cotton transcription factor that regulates the sesquiterpene synthase gene (+)-δ-cadinene synthase-A. Plant Physiol. 135, 507–515.

Yu, Z., Li, J., Yang, C., Hu, W., Wang, L., Chen, X., 2011. The jasmonate-responsive AP2/ERF transcription factors AaERF1 and AaERF2 positively regulate artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.. Mol. Plant 5, 353–365.

Zhang, Y., Teoh, K.H., Reed, D.W., Maes, L., Goossens, A., Olson, D.J., et al., 2008. The molecular cloning of artemisinic aldehyde D11(13) reductase and its role in glandular trichome-dependent biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua. J. Biol. Chem. 283, 21501–21508.

Tinggalkan Balasan

Alamat email Anda tidak akan dipublikasikan. Ruas yang wajib ditandai *